论文摘要：人肝癌特异性结合多肽的进一步筛选与鉴定

背景与目的
肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是一种临床上常见的恶性肿瘤，是严重威胁人类生命安全的杀手之一。中国是肝癌高发国家，目前肝癌治疗主要以手术切除为主，但复发率较高，加上肝癌早期缺乏典型临床症状，早期检出率比较低，大多数病人丧失了最佳手术时机，并且放疗、化疗的毒性极大，效果很不理想。所以，肝癌临床诊治目前面临的最亟待解决的重大需求是早期诊断和靶向治疗的新方法。而实现这一需求的重要条件是发现HCC细胞表面特异的靶分子或者与HCC细胞特异结合的分子片段。
噬菌体肽库技术是目前通用的筛选靶向分子片段的主要方法。通过此技术筛选肿瘤组织特有的分子标识物，已成为肿瘤靶向诊治研究的热点之一。癌组织靶向多肽已成为癌症实现早期分子诊断及靶向治疗突破的新的希望所在。与抗体相比，多肽分子具有结构简单、对组织的穿透力大、不易在体内诱发免疫应答等优点。近年来，多肽作为生物载体用于靶向诊断和治疗的研究有很大进展，多肽分子可被FITC、Cy5等荧光素标记为多肽探针，也可与脂质体、纳米颗粒、抗癌药物等偶联，对癌症进行早期诊断和靶向治疗。
肝癌的早期诊断是提高肝癌患者术后存活率的关键。本研究是在前期筛选出与肝癌细胞HepG2特异结合较好的两个阳性噬菌体克隆的基础上，进一步确定这两个阳性噬菌体克隆的特异性，并合成多肽，多角度研究其与肝癌细胞及组织的结合特异性，以期为将该HCC特异、敏感多肽用于肝癌的早期诊断和治疗研究奠定基础。
方法
1. 本研究前期利用噬菌体肽库技术，以人肝癌细胞HepG2为靶细胞进行生物淘筛（Biopanning），获得两个与肝癌细胞结合特异性和敏感性俱佳的噬菌体克隆（PC6和PC28）；
2. 细胞免疫荧光法、细胞免疫化学法：鉴定噬菌体克隆（PC6和PC28）与HepG2细胞的结合特异性；
3. 将特异性和敏感性最佳克隆序列进行翻译，以其肽序列为模板合成FITC标记的多肽探针；
4. 竞争抑制实验、免疫荧光、流式细胞仪：进一步检测多肽探针的特异性和敏感性；
5. 以MTT法检测多肽对HepG2细胞是否有细胞毒活性；
6. 利用激光共聚焦显微镜检测多肽探针的特异性，并进行定位分析；
7. 以HCC组织芯片方法检测多肽探针与不同病理阶段肝癌组织的结合特异性；
8. 通过生物信息学方法对多肽探针的理化性质及二级结构进行预测分析；
9. 以计算机互联网有关数据库分析预测该HCC特异性多肽在HCC表面可能的靶分子。
结果
1. 细胞免疫荧光法及细胞免疫化学法鉴定结果显示最佳阳性噬菌体克隆为PC28；
2. 对PC28进行DNA测序并分析，根据PC28序列合成多肽探针Hepa probe；
3. 免疫荧光、竞争抑制、流式细胞仪等结果均显示Hepa probe与HepG2有较好的结合特异性；
4. MTT法检测结果表明Hepa probe对HepG2增殖没有影响，提示Hepa probe对HCC细胞可能没有明显细胞毒活性；
5. 激光共聚焦显微镜检测结果表明Hepa probe特异结合于HCC细胞（HepG2和SMMC7721）的细胞膜，这可能是因为细胞表面存在相应靶分子，对此有待深入研究；
6. 通过HCC组织芯片方法检测Hepa probe与不同病理阶段HCC组织的结合特异性，结果显示，Hepa probe与大多数HCC组织具有较好的结合特异性，特别是对分化程度为Ⅱ级的HCC组织具有较好的特异性和敏感性；
7. 影响多肽探针与HCC细胞的结合除了与细胞表面靶分子有关外，可能还与多肽本身的二级结构有关；
8. Hepa probe在HCC表面的靶分子有可能为酪蛋白激酶II（Casein kinase II，CK-2），这是一个在多种肿瘤高表达的多功能的、对多种蛋白具有激酶活性的蛋白。对它与Hepa probe的关系需要进一步研究。
结论
通过噬菌体肽库技术筛选到与HCC细胞具有高度特异性结合力的肽段序列，合成的多肽探针Hepa Probe在细胞水平、组织水平多角度检测中均显示了其良好的特异性和敏感性，特别是对分化程度为Ⅱ级的肝癌组织的特异性和敏感性最佳。Hepa Probe的特异性与它的分子结构有关，其HCC表面可能的靶分子为CK-2。Hepa Probe作为导向载体应用于肝癌的早期诊断和靶向治疗具有良好的应用前景。

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