论文摘要：RNA编辑与棉花叶片衰老关系的初探及一个PPR基因的克隆和表达分析

RNA编辑是转录后RNA成熟过程中的加工和修饰现象，它使得碱基序列发生插入、缺失或替换，从而改变mRNA上携带的遗传信息，最终导致蛋白质的序列发生改变。这种现象广泛存在于昆虫、真菌、黏菌、病毒、植物和人等各种生物体中，高等植物RNA编辑主要发生在叶绿体和线粒体中，是基因转录后表达调控的重要方式之一。本研究以双子叶植物棉花为材料，用RT-PCR技术测定一些叶绿体基因的编辑位点在叶片不同生长时期及衰老时期的RNA编辑效率，探究RNA编辑与植物衰老的关系。此外，本实验还从棉花中克隆了一个可能与RNA编辑相关的PPR基因，对该基因进行生物信息学分析，并确定其在不同组织部位的表达模式及亚细胞定位，同时构建了该基因的过表达载体，转入了拟南芥中。取得的主要研究结果如下：
   1、采用RT-PCR技术克隆中棉16的3个基因：accD、ndhF、rpoB和中棉24的8个基因：atpI、accD、ndhF、psaI、psbF、psbJ、rpoB，测定不同转录本上编辑位点在棉花叶片不同生长时期的RNA编辑效率，结果表明大多数与光合作用相关基因，其编辑位点的编辑效率可能与叶片生长发育有关。当叶片生长到最旺盛时，编辑效率也达到最高，同时随着叶片衰老程度加深，编辑效率表现出下降趋势。
   2、采用Genomic-Walking方法从中棉24（CRRI24）中克隆得到一个长2349bp的PPR基因，命名为GhPPR7，该基因编码782个氨基酸，具有叶绿体定位信号。检测GhPPR7基因在CRRI24的不同组织（根、茎、叶、花和3DAF、6DAF、12DAF、18DAF纤维）的表达模式，结果表明根中表达量最高，叶中次之，纤维中表达量逐渐降低。
3、利用生物信息学分析GhPPR7，结果显示该基因包含15个PPR基序而且在C-末端有额外的保守结构域DYW基序，分子量是88.399kD，理论等电点是7.18，总平均疏水性为0.053，不稳定系数是27.50，属于稳定的蛋白。GhPPR7具有螺旋-转角-螺旋的结构域、糖基转移酶功能结构域和ZnF _CHCC保守结构域。其三级结构可能主要由α-螺旋、延伸链和随机自由卷曲构成。
4、用GhPPR7的信号肽序列通过中间载体pUCegfPC，连接到表达载体pzp211上，利用棉花子叶瞬时表达系统及激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位。结果显示：子叶注射了含GhPPR7sp-eGFP-pzp211载体的农杆菌LBA4404，共培养3天后，在叶绿体中检测到显著的绿色荧光，推测GhPPR7定位于叶绿体。
5.构建35S-GhPPR7-pART7双元表达载体。通过农杆菌介导的真空转化法转入拟南芥中，在kana抗性平板上筛选获得T0代种子。

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