免费论文摘要：Artificial miRNA 介导SmPAP1基因奇异性安静对丹参酚酸类活性因素合成的感化

丹参 (Salvia miltiorrhiza Bunge) 是唇形科鼠尾草属草本植被，以根和根茎入药，是我国要害的国药材之一，有长久的临床运用汗青，具备养护血汗管、抗血栓产生、激动构造的建设和复活等效率。现有接洽表白，丹参的两大活性因素为脂溶性的丹参酮类复合物和水溶性的酚酸类复合物，个中水溶性酚酸类复合物是丹参的重要药用因素之一，赢得一致关心。已有接洽表白，丹参酚酸类复合物的合成过程苯丙烷和酪氨酸两条新陈代谢道路共通介入实行，爆发的迷迭香酸是丹酚酸B的中心前体。暂时对丹参功效基因的接洽已所有打开，酚酸合成道路及其新陈代谢支道路径的要害酶基因均已克隆，而那些酶基因普遍受转录因子的调节和控制。暂时创造，在丹参内过表白外源MYB转录因子基因 (拟南芥PAP1，PAP2)，惹起酚酸类合成道路的酶基因以及关系新陈代谢产品的变革，而丹参内源MYB转录因子能否具备一致调节和控制酚酸类复合物合成的体制，这尚不精确，犯得着接洽。SmPAP1基因 (GenBank:GU218694.2) 是丹参R2R3 MYB类转录因子之一，与拟南芥AtPAP1生存莫大一致性。为商量SmPAP1基因能否介入调节和控制丹参酚酸类合成道路，正文在已有接洽普通上，建立人为miRNA (amiRNA) 载体，旨在对SmPAP1基因举行奇异性安静，商量该转录因子的下调对丹参酚酸类因素合成道路中关系酶基因及新陈代谢产品的感化，精确转录因子SmPAP1丹参酚酸类合成人中学的潜伏调节和控制效率。本接洽旨在商量丹参水溶性酚酸类复合物积聚的效率体制及其调节和控制形式，为丹参分子育种和品德普及奠定普通，为丹参举行品系变革供给新的思绪及战略。重要的接洽实质及截止如次：1.采用SmPAP1非顽固区为沙盘，运用WMD (Web microRNA designer) 平台安排对准SmPAP1的amiRNAs序列，运用臃肿PCR (overlapping PCR) 本领置换拟南芥MIR319a前体序列，建立奇异性安静SmPAP1的人为miRNA载体。2.以丹参根、茎和叶的cDNA为沙盘，运用及时荧光定量PCR本领对SmPAP1基因的表白形式举行了接洽创造，SmPAP1基因在丹参的根、茎和叶中均有表白，但在叶中的丰度最高，茎次之，根中含量较低。3. 运用根癌农杆菌介导的叶盘变化法转染丹参叶片，经DNA和RNA程度的检验和测定后，共赢得转amiRNA-SmPAP1丹参阴性株系8个，运用半定量RT-PCR和及时荧光定量PCR本领对转基因植株检验和测定：转基因株系中SmPAP1均明显低于野生比较，安静功效从30 %-97 %不等。对amiRNA检验和测定截止表露，转基因株系中amiRNA表白平均高度于比较株系，证明建立的amiRNA前体在丹参中胜利表白，实行对靶基因的切割，到达了基因安静的功效。其次，SmPAP1基因在转基因株系的根、茎、叶中都有表白，叶片中表白量最高，根茎较低，同样生存构造表白分别性，且表白丰度均低于在朝生丹参各构造中表白丰度。4. 领会45 d龄构造培植滴定管苗干波及比较株系香港中华总商会酚酸、总黄酮及花青素含量，截止表露三种因素均有贬低：转基因株系4 #的总酚酸、总黄酮及花青素含量辨别是比较的61.56 %、64.05 %和49.47 %；9 #株系的总酚酸、总黄酮及花青素含量辨别是比较的48.42 %、56.88 %和36.81 %；24 #株系的总酚酸、总黄酮及花青素含量辨别是比较的73.68 %、77.57 %和38.35 %。5.沿用HPLC本领检验和测定丹参45 d龄实生苗及比较株系的丹酚酸B的变革，截止表露：转基因株系较比较株系丹酚酸B含量鲜明贬低，4 #和9 #株系中含量仅为比较的44.94 %和50.72 %。6.为了进一步商量SmPAP1基因的表白变革对丹参酚酸类复合物合成道路感化的分子体制，对转基因株系及比较株系酚酸类活性因素次生新陈代谢道路中的10个要害酶基因的表白丰度举行领会。截止表露：苯丙烷重心新陈代谢道路中的PAL、C4H、4CL1、RAS基因以及酪氨酸新陈代谢道路中的TAT和HPPR基因到处干预株系中的表白量较比较明显贬低。类黄酮新陈代谢道路中CHS、FLS基因以及木质素新陈代谢道路的HCT、COMT基因同样有各别水平下调。7.丹参SmPAP1基因安静株系的表型查看截止表露，45 d龄实生苗的根和比较株系生存鲜明分别：因为酚酸合成道路及其木质素、类黄酮平分支道路中要害酶基因均有各别水平下调，所以展示木质素积聚不及，酚酸以及总黄酮等含量较低等局面，引导转基因株系样式爆发变革：地下直根简单且较短，普遍为须根，直根外表浅赤色，质量较脆，植株茎秆纤悉脆弱，容易断裂。论断：本接洽经过建立 artificial miRNA载体介导SmPAP1基因奇异性安静，赢得转基因株系，发端商量SmPAP1转录因子对丹参酚酸类活性因素合成的感化。试验证领会该转录因子经过调节和控制新陈代谢道路要害酶的表白，从而感化次生新陈代谢产品的积聚，证明SmPAP1转录因子在丹参酚酸类物资的合成及表白中具备要害的调节和控制效率。这为普及药用植被中次生新陈代谢产品的积聚供给新的思绪。

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