论文摘要：光动力疗法对乳腺癌细胞MCF-7及其耐药株MCF-7/ADR细胞损伤及死亡应答的比较

研究背景及目的

光动力疗法（Photodynamic Therapy，PDT）主要利用肿瘤细胞及正常细胞对光敏剂有不同的亲和特性，肿瘤细胞摄取和存留光敏剂较多，经特定波长的光照射，在生物组织中氧的参与下发生光化学反应，产生单态氧和自由基，破坏组织和细胞中的多种生物大分子，最终引起肿瘤细胞死亡。光动力疗法以其有效、安全、副作用小、可协同性、相对成本低等优点脱颖而出，已被加拿大、美国、法国、荷兰等国家批准用于一定范围内的抗肿瘤和非肿瘤疾病的临床治疗。

光动力反应需要具备的两个基本的要素：光敏剂、光。理想的光敏剂应该满足良好的化学稳定性、水溶性好、肿瘤选择性高、单态氧产量高、肿瘤组织滞留时间短等特点。迄今研究发现的可用于光动力治疗的光敏剂主要分为卟啉衍生物类和叶绿素衍生物类。光照是光动力反应的另一个关键要素，某些特定波长的光被吸收，使光敏剂从基态转入激发态，从而将电子传递给氧分子，形成单线态氧。影响光动力疗法的因素不仅包括光照剂量大小及光敏剂种类，同时还包括细胞中光敏剂的富集量。光敏剂的前期研究表明，过表达ABCG2的H1650 MX50能够显著减少细胞内PhA、Ce6、MPPa、HpIX的富集量；过表达ABCG2的HEK-293细胞对PhA、MPPa、Ce6、ALA的相对抗性分别提高了11、30、4、7倍。然而ABC家族蛋白通过降低细胞中光敏剂富集量影响光动力疗法的作用机制尚未清楚。

本论文在前期研究工作的基础上，以离体培养的人乳腺癌细胞MCF-7及高表达ABCG2、P-gp的细胞亚系MCF-7/ADR为实验模型，从MCF-7、MCF-7/ADR细胞对Ce6-PDT敏感性、细胞损伤、细胞死亡应答进行研究，以期为PDT提供扎实的理论基础。

研究方法及结果：

第一部分 Ce6-PDT对MCF-7及MCF-7/ADR细胞生长抑制的比较  通过MCF-7/ADR细胞的生长曲线的绘制，选择适当的细胞密度研究不同化疗药物对两种细胞的生长抑制作用，以及不同浓度的Ce6结合不同光照强度对MCF-7及MCF-7/ADR生长抑制作用。实验结果如下：① 噻唑蓝（MTT）比色法显示阿霉素、紫杉醇、顺铂对两种细胞的毒性具有浓度依赖性，同时MCF-7的敏感性显著高于MCF-7/ADR（p<0.05）。②不同Ce6浓度（0.1，0.2，0.5 µg/ml）、不同光照强度（1.4，2.8，5.6 J/cm2）的Ce6-PDT对MCF-7及MCF-7/ADR细胞存活率的影响显示，PDT抑制MCF-7及MCF-7/ADR细胞生长具有Ce6剂量和光照强度依赖性，且相同条件下Ce6-PDT对MCF-7的抑制作用更强（p<0.05）。实验结果表明Ce6-PDT对MCF-7生长抑制作用更强。

第二部分 Ce6-PDT导致MCF-7更严重的细胞损伤  本部分实验主要研究了0.5 µg/ml的Ce6结合不同光照剂量(1.4 J/cm2、2.8 J/cm2、5.6 J/cm2)处理后， MCF-7、MCF-7/ADR细胞活性氧生成及细胞核、DNA损伤，同时研究了ABCG2及P-gp在MCF-7/ADR细胞对Ce6-PDT敏感性中的作用。实验结果显示：①划痕实验显示Ce6-PDT处理后，MCF-7及MCF-7/ADR迁移能力下降，相同处理后对MCF-7迁移能力有更强的抑制（p<0.05）。②Ce6-PDT处理后DCFH-DA染色检测MCF-7及MCF-7/ADR细胞中活性氧含量明显上升，且MCF-7细胞中ROS含量显著高于MCF-7/ADR。③Hochest 33342染色及彗星电泳结果显示MCF-7细胞中DNA损伤明显高于MCF-7/ADR（p<0.01）。④FTC和LY335979能增强MCF-7/ADR对Ce6-PDT的敏感性（p<0.01），同时MCF-7/ADR细胞内Ce6含量显著上升（p<0.05）。⑤扫描电镜显示Ce6-PDT处理后MCF-7及MCF-7/ADR细胞表面微绒毛减少，细胞变圆，同时伪足消失。实验结果表明PDT处理后，产生大量活性氧，从而引起细胞损伤，且MCF-7损伤明显高于MCF-7/ADR。

第三部分 MCF-7及MCF-7/ADR发生不同的死亡应答  实验主要通过流式细胞仪检测了Ce6-PDT处理后，MCF-7、MCF-7/ADR细胞的凋亡比例，并探究了MCF-7/ADR对Ce6-PDT的死亡应答。实验结果如下：①Annexin V–FITC/PI检测显示，Ce6-PDT处理后MCF-7细胞发生凋亡。②与自噬抑制剂3-MA和巴佛洛霉素A1孵育后，MCF-7/ADR细胞存活率明显上升（p<0.01）。③MDC染色显示Ce6-PDT处理后MCF-7/ADR细胞中出现阳性自噬泡；Western blot显示Ce6-PDT处理后LC3Ⅱ表达增加。综上，Ce6-PDT诱导MCF-7发生凋亡，而MCF-7/ADR发生自噬。

结论：

综合上述实验，通过检测细胞中活性氧的产量、细胞核及DNA损伤等，探究了MCF-7、MCF-7/ADR细胞在Ce6-PDT处理后不同敏感性的机制，证明MCF-7/ADR高表达ABCG2及P-gp能显著降低细胞中Ce6富集量，Ce6-PDT引起MCF-7发生凋亡应答，导致MCF-7/ADR发生自噬性应答。

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