论文摘要：基于杂交链式反应研究酶和核酸的荧光新方法

核酸探针信号放大技术是近年发展起来的一种高灵敏检测手段，已成为生命分析化学领域中的一个研究重点和热点。基于分子识别诱发的信号放大反应，本论文利用杂交链式反应放大技术，建立了研究酶活性及抑制的荧光新方法，提出了灵敏检测端粒酶RNA的新策略。具体研究内容包括以下三个方面:

一、基于DNA纳米线的自组装级联扩增检测T4多聚核苷酸激酶的活性及抑制的研究

灵敏检测PNK活性以及抑制剂在核酸磷酸化的生物过程、分子靶向治疗和开发以激酶为目标物的药物研发方面均具有重要意义。本节中，以发夹型核酸探针H1为分子识别探针，N-甲基卟啉二丙酸 IX (NMM)为信号探针，基于lambda核酸外切酶(λ exo)对磷酸化DNA的特异性切割而启动的杂交链式反应(HCR)，建立了一种研究T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)活性及抑制的荧光法。T4 PNK催化核酸探针H1 5′羟基端磷酸化，λ exo特异性水解磷酸化发夹探针释放出单链DNA作为HCR的引发链，使得在发夹探针H2和H3间发生杂交链式反应，形成长的双链DNA纳米线。同时，在核酸探针H2和H3的末端可以形成分子间四链体DNA。作为一种可以特异性结合四链体DNA的荧光探针NMM，其荧光信号明显增强，由此实现灵敏检测T4 PNK的活性，检出限为3.37×10-4 U/mL。不同抑制剂对T4 PNK活性的抑制效率研究表明，该方法还可用于T4 PNK抑制剂的研究。因此，该方法是一种无需标记、低成本、高选择性地检测PNK活性及研究酶抑制剂的荧光法。

二、基于杂交链式反应灵敏检测端粒酶RNA表达水平的研究

人端粒酶RNA（hTR）在多种肿瘤中高表达，实现hTR的灵敏检测对肿瘤诊断与治疗具有重要意义。本节利用氧化石墨烯（GO）为纳米载体，结合杂交链式反应的信号放大，建立了一种灵敏检测细胞内hTR的荧光法。首先，将荧光标记的发夹型核酸探针H1和H2 负载到GO表面，荧光标记的发夹型核酸探针的荧光被GO所猝灭。然后，利用GO将核酸探针输送到细胞中。 hTR存在时，可引发杂交链式反应，形成长的双链DNA聚合物。由于双链DNA聚合物具有较强的刚性结构可以从GO表面脱落，核酸探针荧光信号恢复。通过荧光光谱和成像对hTR的表达水平进行考察，该方法还可用以区分单碱基突变。因此，该方法为高选择性地灵敏检测细胞内端粒酶RNA的表达水平提供了新途径。

三、基于G-四链体结构诱导的荧光猝灭效应高通量筛选G-四链体配体的研究

端粒DNA末端形成稳定的G-四链体结构是抑制端粒酶活性的有效途径之一。发现能够与端粒DNA形成稳定G-四链体结构的配体，对于以端粒酶为靶点的抗肿瘤药物开发具有重要意义。目前已建立多种识别G-四链体配体的方法，仍然缺乏高通量、低成本、简便易行筛选G-四链体配体的方法。为了解决这个问题，本节基于光诱导电子转移效应，建立了一种简单、快速、高通量筛选G-四链体配体的荧光法。由于配体分子可以诱导羧基荧光素（FAM）标记的人端粒DNA形成G-四链体，导致FAM堆积在G四分体平面上而与G碱基靠近发生光诱导电子转移，使得F-hpDNA荧光强度降低。基于配体分子引起的荧光猝灭可实现G-四链体配体的筛选。96-孔板筛选结果表明此方法提供了一个性能优良的高通量筛选方法，可以实现快速筛选G-四链体配体。通过圆二色光谱验证了G-四链体结构的形成，TRAP实验证明了大黄素可以抑制端粒酶的活性，此外，细胞荧光成像以及MTT细胞增殖实验进一步验证了所筛选的配体具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。该方法具有成本低、响应速度快、无需复杂仪器等优点，为筛选G-四链体配体提供了一种简便可靠的途径。

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