论文摘要：解纤维素固氮芽胞杆菌菌种选育的研究

过量使用化肥对土壤环境和农作物品质的负面效应已引起普遍关注，使用有机肥和微生物制剂来提高土壤肥力，实现土壤的可持续利用，已成为人们的共识。解纤维素固氮芽胞杆菌能利用作物的残留物、秸秆还田和有机肥中的纤维素作为碳源和能源进行固氮生长，更能适应土壤环境。与不产生芽孢的固氮菌相比，芽胞杆菌的抗逆性更强，制剂的保存期更长。筛选和选育降解纤维素能力强、固氮量高的芽胞杆菌，具有重要的理论和实践意义。本研究在探讨解纤维素固氮芽胞杆菌AX32与伴生菌AX322相互关系的基础上，采用UV和NTG诱变，依据不同的筛选策略，获得了纤维素酶活、固氮量和生长量提高的突变株，在抗药性突变株、泌氨突变株和耐氨突变株的筛选方面也进行了探索。主要研究内容和结果如下：

  （1）从陕西、山西、湖北等省采集的不同作物根际土壤中，筛选解纤维素固氮芽胞杆菌，发现常有伴生菌生长，在建立解纤维素固氮芽胞杆菌与伴生菌纯化方法的基础上，对菌株进行了鉴定，探讨了二者之间的相互关系。结果表明：解纤维素固氮芽胞杆菌AX32为栗树类芽胞杆菌（Paenibacillus castaneae），伴生菌AX322为根癌土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）；混合培养与单独培养相比，两种菌活菌数量降低，二者种间关系为竞争，但混合培养时纤维素酶活性和固氮量均提高。

  （2）对解纤维素固氮芽胞杆菌AX32的纤维素酶特性和产酶条件进行优化。酶反应的最适pH为7.0，最适温度为30℃，酶活性在pH6.8～7.4和22～45℃较稳定。在优化后的培养基和培养条件下，AX32发酵液中粗酶活力可以达到5.385×10-9mol/s，与最初的4.658×10-9mol/s 相比，酶活提高了15.61%。

   （3）将解纤维素固氮芽胞杆菌AX32对数生长期的细胞，用紫外线和亚硝基胍进行诱变，依据不同的筛选策略，获得了不同类型的突变株。高酶活突变株NTG-50E，纤维素酶活性达到6.593×10-9mol/s，比出发菌株AX32提高32.1%。高固氮量突变株NTG-40-2NF，固氮量达到0.0966mg/mL，比出发菌株AX32提高54.6%。高生长量突变株UV-25-1G，生长量达到3.46×108，比出发菌株AX32提高45.4%。抗青霉素突变株Pr-1，微晶纤维素酶活力为5.189×10-9mol/s，比出发菌株AX32提高7.7%；固氮量为0.0649mg/mL，比出发菌株AX32提高5.02%；生长量为2.508×108，比出发菌株AX32提高13.1%。抗链霉素突变株Sr-1，微晶纤维素酶活力为5.2×10-9mol/s，比出发菌株AX32提高9.7%；固氮量为0.0678mg/mL，比出发菌株AX32提高9.7%；生长量为2.42×108，比出发菌株AX32提高9.2%。抗利福平突变株Rr-1，微晶纤维素酶活力为5.432×10-9mol/s，比出发菌株AX32提高12.7%；固氮量为0.0669mg/mL，比出发菌株AX32提高8.3%；生长量为2.5×108，比出发菌株AX32提高12.8%。通过传代试验，突变株遗传特性稳定。

   （4）采用紫外线和亚硝基胍对AX32进行诱变，设计不同的筛选策略，获得了耐氨突变株和泌氨突变株。耐氨突变株NTG-60-NR，固氮量为0.0953mg/mL，与出发菌株AX32(0.0623mg/mL)相比，提高53%。泌氨突变株UV-25-NS，固氮量为0.1076mg/mL，与出发菌株AX32(0.0615mg/mL)相比，提高75%。经传代试验，耐氨突变株和泌氨突变株遗传特性稳定。

    本文得出的结论如下：

   （1）从不同地区土样中分离筛选到解纤维素固氮芽胞杆菌AX32为栗树类芽胞杆菌(Paenibacillus castaneae)；与其伴生的小菌落AX322为根癌土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ），二者种间关系为竞争。

   （2）解纤维素固氮芽胞杆菌AX32微晶纤维素酶作用的最适pH为7.0，最适温度为30℃，酶活性在pH6.8～7.4和22～45℃较稳定。在优化后的培养基和培养条件下，AX32发酵液中粗酶活力可以达到5.385×10-9mol/s，与最初的4.658×10-9mol/s 相比，酶活提高15.61%。

（3）用紫外线和亚硝基胍进行诱变，筛选到纤维素酶活性、固氮量和生长量提高的突变株以及抗药性突变株、耐氨突变株和泌氨突变株。传代证实遗传特性稳定。

 本文的创新之处：（1）分离到解纤维素固氮芽胞杆菌为栗树类芽胞杆菌（Paenibacillus castaneae）和伴生菌为根癌土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ），发现二者之间为竞争关系。（2）采用UV和NTG诱变，筛选到纤维素酶活性、固氮量和生长量提高的突变株以及抗药性、耐氨和泌氨突变株，突变株遗传特性稳定。

 由于时间限制，本研究只获得了不同的突变菌株，如能继续进行多亲本递进式原生质体融合，有可能获得酶活、生长速率及固氮能力提高的融合菌株。

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