论文摘要：HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂细胞筛选模型构建方法的建立

世界范围高感染率的HCV，是由膜包裹的正链RNA病毒，其非结构蛋白NS3在HCV整个非结构蛋白加工和成熟过程中发挥关键作用。NS4A与NS3结合，加强了NS3蛋白酶的切割作用，形成具有最佳催化活性的异二聚体丝氨酸蛋白酶—— NS3/4A蛋白酶，对其自身及下游四个非结构蛋白位点：NS3/NS4A/NS4B /NS5A/NS5B进行切割，将HCV蛋白前体加工成多个重要的病毒活性酶。此外NS3还具有其他生物学活性：RNA解旋酶活性及NTP酶活性。NS3/4A还参与HCV对宿主固有免疫系统的应答逃避，为HCV的持续慢性感染提供条件。由此，可以看出NS3/4A是HCV里的一种多功能分子，抑制它的活性既可以阻断HCV的复制、翻译及翻译后蛋白前体的加工成熟，又可以使干扰素充分发挥其抗病毒作用。
鉴于NS3/4A的上述特性，同时丝氨酸蛋白酶还是相对容易控制的靶点，借鉴蛋白酶抑制剂治疗HIV感染的成功经验，许多研究机构与制药企业已经开始了HCV特异靶点抗病毒治疗药物（specifically targeted antiviral therapy for HCV，STAT-C）尤其是HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶选择性抑制剂的研发。目前进入临床试验的候选药物VX-950，SCH-503034，ACH-806与MK-7009等与PEG-IFNα联用虽然都提高了SVR（提高至55-69%），但是，它们都具有较严重的副反应，往往引起皮疹、瘙痒、贫血甚至心、肾功能紊乱等。因此，继续寻找安全有效的NS3-4A蛋白酶抑制剂十分必要。
对此，本课题利用EGFP报告蛋白，建立了HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑剂细胞可视化筛选模型的构建方法，并对该筛选模型进行优化。基本原理是：在EGFP内部选取合适的位点插入NS5A/5B序列，形成仍具绿色荧光的报告分子EGFP5AB。EGFP5AB蛋白内的NS5A/5B位点被NS3/4A切割，EGFP5AB蛋白断裂成两部分后荧光消失。因此，该模型可以通过检测荧光效果来可视化地评价NS3/4A丝氨酸蛋白酶的活性，从而筛选NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂。以该监测系统为基础可以筛选和评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用效果，为新型抗HCV药物的筛选和评价提供基础资料。              
具体研究内容和结果如下：
第一部分 优化报告分子、宿主细胞和转染条件
在EGFP中选择合适的NS5AB插入位点,构建报告分子
分别在155Aa位点（EGFP的第155Aa与156Aa之间），158Aa位点（EGFP的第158Aa与159Aa之间）和173Aa位点（EGFP的第173Aa与174Aa之间）插入NS5AB序列(NS3/4A的识别序列)，构建以PcDNA3.1为载体的ZE1555AB，ZE1585AB，ZE1735AB的质粒。
同理，构建对照组质粒：在NS5A与NS5B之间插入F2A序列，构建ZE1555AB-2A，ZE1585AB-2A和ZE1735AB-2A质粒； 用2A序列将ZE1555AB，ZE1585AB，ZE1735AB及EGFP与精简的scNS3/4A序列连接，构建zE1555AB-2A-NS3/4A，zE1585AB-2A-NS3/4A, zE1735AB-2A-NS3/4A和zEGFP-2A-NS3/4A质粒；构建真核载体上的EGFP质粒。
选择合适的宿主细胞，优化转染条件
将以上质粒分别瞬时转染到HeLa，CHO-K1和HEK293A三种哺乳动物细胞中。优化转染条件，使用荧光显微镜观察绿色荧光情况。选择CHO-K1为合适的转染细胞，EGFP的173Aa位点为合适的NS5AB插入位点。
第二部分 原核表达检测、优化目的筛选分子最终获得细胞筛选模型
构建原核质粒，转化到大肠杆菌中，观察蛋白表达：
构建以pET-28a为载体的EGFP和E1735AB质粒，以pET-22b为载体的NS3/4A质粒，分别转染到大肠杆菌中诱导表达，检测到其正确的蛋白表达及相应的荧光情况。分别将EGFP和E1735AB质粒与NS3/4A质粒共转到一个大肠杆菌中，诱导表达，检测到其正确的蛋白表达及相应的荧光情况。
含有NS3/4A的大肠杆菌的诱导表达，菌体形态发生改变，对其诱导体系进行了优化，可以清楚地看到诱导前后菌体形态的改变。
优化目的筛选模型分子,获得细胞筛选模型：
构建目的筛选系统质粒zE1735AB-2A-NS3/4A、zE1735AB-IRES-NS3/4A,选择检测效果较好的zE1735AB-IRES-NS3/4A质粒，转染到CHO-K1细胞中，Western Blot检测到目的蛋白的切割条带，获得细胞筛选模型。
以上研究结果表明，我们建立了一种可视化哺乳动物细胞内NS3/4A蛋白酶抑制剂筛选模型的构建方法，通过报告分子的绿色荧光情况来可以用于可视化的筛选NS3/4A蛋酶抑制剂。这为今后初步筛选和验证NS3/4A蛋白酶抑制剂奠定了基础。只要对识别序列进行更换，该方法还可用于检测类似的蛋白酶活性及进行相应抑制剂筛选。

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