免费论文摘要：人泡沫逆转录宏病毒LTR和IP启用子的活性接洽

泡沫逆转录宏病毒（Foamy virus, FV）属于逆转录宏病毒科（Retroviridae）泡沫宏病毒亚科（Spumaretrovirinae）泡沫宏病毒属。因其熏染细胞后可开辟爆发一致泡沫的空泡、多核细胞而得名。泡沫宏病毒宿主范畴广，能在宿主体内创造终生的连接性熏染而无鲜明致病性。它还具备普遍的细胞趋性，能熏染多种典型的细胞。泡沫宏病毒的基因组较长，基因承载含量大，能带领较大的外源基因。那些特性使它变成基因调节载体的接洽热门。与其余逆转录宏病毒各别的是，FV不只具备典范的5′ LTR启用子（简称LTR），在env基因3′终局再有一个里面启用子（Internal promoter, IP）。前者重要调节和控制泡沫宏病毒构造卵白Gag、Pol、Env的基因转录和表白，后者则调节和控制PFV扶助卵白Bel1/Tas和Bet的基因转录和表白。Bel1/Tas是反式激活因子，它不妨与LTR和IP贯串，反式激活启用子，两个启用子的活性都激烈依附于Bel1/Tas。LTR和IP不只普通活性各别，并且在泡沫宏病毒熏染的各别细胞内活性也不沟通。这是因为不只有宏病毒因子介入对宏病毒启用子LTR和IP的活性安排，也有宿主细胞的某些因子对宏病毒启用子的活性爆发感化，从而对宏病毒的复制爆发感化。泡沫宏病毒对各别细胞的熏染情景各别，在某些细胞内爆发裂解熏染，如BHK-21、U87-MG、HT1080、等；在某些细胞内爆发湮没熏染，如Jurkat、Raji、293T、U937细胞等。这与宏病毒和宿主细胞的彼此效率相关。宏病毒侵染宿主细胞后会激活宿主细胞的免疫性体例，如细胞内典范的免疫性调节和控制通路—NF-κB旗号通路。NF-κB，即核因子κB，是细胞中的一类要害转录因子，在细胞增殖、发育、分裂、存活以及免疫性、炎症反馈进程中介入基因的表白与调节和控制。与此同声，宏病毒也进化出相映的战略安排细胞的NF-κB旗号通路，运用宿主细胞某些因子实行宏病毒自己复制。本试验以人泡沫宏病毒(Human foamy virus, HFV)全长克隆pHSRV13质粒为沙盘，安排奇异性引物PCR扩大与增加启用子LTR和IP的序列，将它们辨别克隆到含有荧光素酶汇报基因的真核表白载体pGL3-Basic中，建立重组载体。经过刹时转染细胞检验和测定荧光素酶汇报基因的表白量，领会比拟HFV LTR和IP两类启用子的普通活性以及在反式激活因子Bel1/Tas效率下的激活活性，探求这两类启用子在HFV熏染各别典型细胞中的活性变革顺序。同声，接洽泡沫宏病毒的反式激活因子Bel1/Tas与宿主细胞NF-κB的效率以及NF-κB对宏病毒启用子LTR和IP活性的安排效率。本舆论博得的功效如次：1.建立LTR和IP系列荧光素酶汇报基因表白载体：PCR扩大与增加启用子LTR（1-1121）、LTR（1-780）、IP（9019-9195）、IP（9019-9438）序列，将它们辨别克隆到含荧光素酶汇报基因的真核表白载体pGL3-Basic上，经过菌落PCR、酶切审定和测序对重组子举行审定，决定汇报基因载体建立胜利。2.建立pCI-bel1/tas真核表白载体：PCR扩大与增加bel1/tas基因约1 kb，将手段片断与载体贯穿后，对重组子举行菌落PCR挑选和酶切审定。将测序截止与沙盘pHSRV13举行序列比对，截止与预期符合，证明pCI-bel1/tas真核表白载体建立胜利。3.LTR和IP系列汇报基因质粒的刹时转染：索取去内毒素的质粒pGL3-LTR（1-1121）、pGL3-LTR（1-780）、pGL3-IP（9019-9195）、pGL3-IP（9019-9438）、pCI-bel1/tas，运用脂质体转染试药Lipofectamine 2000将上述启用子质粒刹时转染BHK-21、HT1080、HeLa、U87-MG等细胞，同声共转染pCI-bel1/tas表白质粒。经过双荧光素酶汇报基因检验和测定体例对荧光素酶汇报基因的表白量举行检验和测定，对启用子活性领会创造，LTR普通活性低于IP的普通活性。当LTR和IP被Bel1/Tas反式激活后，LTR（1-780）（即LTR U3区）的激活活性高于LTR（1-1121）（即LTR全长）的激活活性，由此估计，LTR启用子的U3区对LTR启用子的转录活性具备正调节和控制效率，而RU5区对LTR启用子的活性有负调节和控制效率。IP中心序列在HFV原宏病毒基因组DNA上坐落第9019-9195 nt，而IP（9019-9438）的激活活性高于IP（9019-9195）（即IP中心区）的激活活性，所以大概有细胞因子效率于IP中心序列的卑劣介入调节和控制IP的活性。4.NFκB-TA-luc汇报质粒与pCI-bel1/tas质粒的刹时转染：索取去内毒素的质粒NFκB-TA-luc、pCI-bel1/tas和pCI-neo，共转染NFκB-TA-luc和pCI-bel1/tas动作试验组，以NFκB-TA-luc和pCI-neo共转染组动作阴性比较，经过双荧光素酶汇报基因检验和测定体例对荧光素酶汇报基因的表白量举行检验和测定，截止领会表白：宏病毒因子Bel1/Tas不妨与宿主细胞NF-κB爆发彼此效率。

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