论文摘要：中华蚱蜢的比较转录组及线粒体转录组作图研究

为构建直翅目昆虫生命之树、开展直翅目昆虫线粒体转录组基因表达研究以及直翅目昆虫个体生长发育和性别分化分子调控机制的探索，本文利用HiseqTM2000高通量测序平台对中华蚱蜢（Acrida cinerea Thunberg）的雌性若虫、雌性成虫、雄性成虫样本分别进行转录组测序，将测序reads进行无参考基因组的从头组装获得中华蚱蜢的转录组Unigene，并对Unigene进行功能注释和GO、KEGG等蛋白功能分类和代谢途径分析。进一步通过成若虫和雌雄成虫样品间的转录组Unigene的差异比较，筛选出与生长发育和性别决定相关的差异基因，进行相关功能的鉴定和参与的代谢通路的初步分析。以中华蚱蜢线粒体基因组全序列为参考序列进行了测序reads和线粒体Unigene的覆盖作图分析。在研究中获得的主要结论如下：
（1）        高通量测序原始读序经过数据过滤后，雌性若虫获得2×34,779,159条clean reads，雌性成虫获得2×35,838,536条clean reads，雄性成虫获得2×26,234,028条clean reads，测序总量分别达6.95 Gb、7.16 Gb和5.24 Gb。采用reads合并的拼接策略进行无参考基因组的从头组装，最后获得59,699个中华蚱蜢的Unigene，碱基总长度达31,938,874 bp。采用各样品的clean reads比对回Unigene的策略，获得中华蚱蜢雌性若虫、雌性成虫、雄性成虫各自表达的Unigene分别为53,623、55,802、50,177个。
（2）        对获得的59,699个Unigene使用Blast相似性比对方法进行基因功能注释后，共有26,700个Unigene获得注释，占到Unigene总数的44.72%，其中有22,176个注释到Nr库，17,057注释到Swiss-Prot库，9,295注释到Nt库，6,770注释到COG数据库，有12,075个获得了GO功能注释和分类信息，有24,645个注释到237条KEGG pathway中。这些详细的Unigene功能注释和分类信息为进一步进行中华蚱蜢Unigene参与生命活动及基因调控的各方面研究提供了依据。超过50%没有获得明确功能信息的Unigene为中华蚱蜢的新基因挖掘提供重要依据。
（3）        采用随机抽样的假设检验方法进行样品间差异基因的筛选，在雌性若虫和雌性成虫之间共筛选出5,444个差异基因，雌性成虫与雄性成虫之间共8,073个。共获得229个仅在雌性若虫中表达的基因，442个仅在雌性成虫中表达的基因和848个仅在雄性成虫中表达的基因。上述差异表达基因的获得为中华蚱蜢生长发育和性别分化相关基因的鉴定以及相互作用的研究提供了重要参考。
（4）        样品间差异表达基因的GO功能分类和富集分析结果表明，雌性若虫在新陈代谢、细胞成分组织以及维持机体正常代谢的生物学调控过程中特异基因较多，雌性个体较雄性个体在大分子复合物组分、细胞器组分、转导调控以及细胞过程、代谢过程中拥有更多的特异性表达基因，而雄性个体则在细胞膜组分、电子载体、酶活性调节以及生殖过程中表现出更多特异性基因，推测中华蚱蜢雌性若虫在新成代谢和物质积累方面基因表达活跃，而雌性成虫在成熟阶段为保证生殖的顺利进行，从新陈代谢等各方面均较雄性个体活跃，而雄性成虫在生殖和环境适应等方面可能具有更多的基因表达投资。同时对差异表达基因的KEGG pathway注释和富集分析表明，中华蚱蜢雌性若虫和雌性成虫在237条代谢途径中有85条存在差异基因的表达，其中有11条为差异基因显著富集的途径，而雌性成虫与雄性成虫之间存在差异基因的代谢途径有123条，其中有20条为差异基因显著富集的途径，在这些富集途径的综合比较中，本文推测中华蚱蜢在个体成长过程相关的新陈代谢通路方面差异较大，而雌雄个体在成熟阶段基因差异表达的代谢途径已经向生殖和激素调控等相关的代谢途径转化。
（5）        使用三样品clean reads对线粒体基因组的覆盖作图结果表明，95.38%的碱基位点获得测序覆盖，中华蚱蜢雌性若虫、雌性成虫、雄性成虫在线粒体基因表达图式和表达量趋势上基本一致，l-rRNA、COX1、CYTB等是reads覆盖最高的基因，l-rRNA覆盖度最高的原因可能是存在独立而高效的转录起点，s-rRNA覆盖较低可能是由较短的poly(A)尾导致的低效测序造成，部分tRNA基因可能位于多聚腺苷酸化的转录中间产物3′端而获得测序，中华蚱蜢可能存在类似黑腹果蝇5个转录单位的线粒体转录加工机制。筛选获得的44个线粒体Unigene中存在9个可能的转录中间产物Unigene，COX1基因的起始密码子应该为ACC，ND2、COX1、COX2、ND5的不完全终止密码子可能在tRNA加工过程中由多聚腺苷酸加尾过程完善。
本研究是首次对直翅目剑角蝗科代表物种进行的转录组研究，获得的大量基因数据将对基于谱系基因组学方法的直翅目昆虫生命之树的构建提供支持，并对今后深入开展蝗虫的系统发育、类群进化研究及其直翅目昆虫的系统发生分析产生深远影响。同时，通过其成若虫和雌雄成虫之间比较转录组学研究，获得的大量雌雄性别分化基因和个体生长相关基因，将为深入研究和解析蝗虫的基因组转录调控机制及其个体生长和性别分化的遗传机制提供有益帮助。

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