免费论文摘要：SEC24B基因在斑马鱼胚胎毛育进程中的功效

神办理反常（NTD）是因为胚胎毛育早期神办理不紧闭或紧闭不实足惹起的一类重要的出身缺点，由情况及遗传成分共通效率惹起。暂时的接洽已证明平面细胞极性旗号通路中Vangl2基因与该病症的爆发出色关系。随后在小鼠模子中证明包被复合物Ⅱ（COPⅡ）转运卵白Sec24b卵白不妨奇异性地与Vangl2卵白贯串，介导Vangl2卵白从内质网至高尔基体的转运。并且Sec24b基因渐变会感化Vangl2卵白由内质网向高尔基体的输送进程，惹起小鼠展示神办理反常。本试验室前期的接洽创造生人神办理反常患者SEC24B基因源代码区私有的四个错义渐变（F227S、F682L、R1248Q及A1251G），但其功效有待于考证。同声因为没辙在人体径直接洽该基因的功效，是否用斑马鱼动作平台来接洽也是有待于处置的题目。本接洽的实质及截止如次：1.Sec24b基因的底栖生物消息学领会从NCBI数据库载入人和斑马鱼等底栖生物的SEC24B基因序列，用底栖生物消息学软硬件举行领会。截止表白：生人和斑马鱼的SEC24B基因的一致度为77%。2. 斑马鱼Sec24b基因的克隆及功效领会(1)索取斑马鱼的总RNA，RT-PCR本领克隆Sec24b基因，测序考证；(2)用合成的地高辛标志的Sec24b基因反义RNA探针举行整胚胎原位杂交及冰冻切片，检验和测定Sec24b基因在胚胎各别发育功夫的表白；(3)反义干预试验：用大麻啉（Morpholino）标志的反义寡核苷酸与mRNA贯串，阻断翻译，查看对胚胎表型的感化；(4)过表白试验：将SEC24B-WT、SEC24B-Y613和机载体质粒辨别打针斑马鱼胚胎，查看SEC24B基因野生型及渐变体过表白惹起的效力；(5)全党外救济试验：以人源SEC24B-WT、SEC24B-Y613X和Sec24b-EGFP质粒辨别与Sec24b-MO共打针受精卵，查看统计胚胎表型变革。截止：①胜利克隆到斑马鱼Sec24b基因，长度为495bp，可用来动作下一步的探针沙盘；②整胚胎原位杂交创造，在胚胎毛育早期Sec24b生存母效表白效力，旗号普遍散布于胚胎细胞内，从尾芽期发端，深染部位会合于脑部和神经构造，证明Sec24b表白发端展示构造奇异性。受精后36个钟点，Sec24b表白会合在脑部、视囊、软骨等部位，其余地区仍旧检验和测定不到Sec24b旗号；③大麻啉化装的反义寡核苷酸（Sec24b-MO）举行基因敲低后创造，打针后胚胎脑部体积鲜明减小，眼睛发育不实足，体长减少，体轴委曲等一致Vangl2基因渐变惹起的表型；④过表白试验创造，集聚蔓延效率遭到透彻的剂量调节和控制，不及或适量均不妨惹起集聚蔓延效率特殊；⑤救济试验证明，人的SEC24B基因不妨对斑马鱼的该基因展现出弥补效力。所以，斑马鱼模子不妨动作生人SEC24B基因渐变的功效考证体例。4. 生人神办理反常患者SEC24B基因渐变体关系功效领会  借助斑马鱼体制和细胞体制，领会错意渐变的SEC24B基因表白情景及SEC24B卵白与VANGL2卵白的生物化学互作爆发感化及细胞内的定位情景，考证SEC24B基因能否与NTD的爆发关系。本局部实质囊括：(1)建立带有Myc标签的野生型及渐变型表白载体（pCMV6-SEC24B-F227S-myc，pCMV6-SEC24B-F682L-myc，pCMV-SEC24B-R1248Q-myc，pCMV6-SEC24B-A1251G-myc），辨别转染至HKE293T细胞，Western blot检验和测定表白；(2)随后用免疫性共积淀决定SEC24B卵白与VANGL2卵白在细胞内的效率情景；(3)用siRNA安静内源Sec24b基因，转入外源野生及渐变型质粒，经过荧光共定位本领及免疫性组化检验和测定野生及渐变型SEC24B卵白与VANGL2卵白的共定位情景；(4)辨别用各别浓淡的野生型及5种渐变型的质粒与Sec24b-MO共打针斑马鱼胚胎，举行全党外救济试验，查看胚胎表型变革情景。截止表白：⑴F227S、F682L渐变后其在细胞内的表白宁静性贬低了，表白量鲜明低于野生型；⑵免疫性共积淀的截止也表露这两处渐变感化了SEC24B卵白与VANGL2卵白的互作，引导SEC24B卵白与VANGL2卵白的彼此效率的缩小以至流失；⑶细胞内荧光共定位及免疫性组化截止表露，F227S和R1248Q变换了Vangl2卵白由内质网的运出办法，使Vangl2卵白洪量的淹留于内质网，而R1248Q、A1251G渐变引导Vangl2卵白局部淹留于内质网，F682L对Vangl2卵白的输送情景感化不鲜明；⑷体内救济试验创造：4个渐变体都不许鲜明救济胚胎反常，F682L和R1248Q不妨局部救济反常。论断：Sec24b基因功效的缺点和失误会感化VANGL2的输送，形成斑马鱼展示一致神办理反常的表型；人SEC24B基因在确定水平上不妨对斑马鱼Sec24b敲低举行弥补；人SEC24B基因4个错意渐变中，惟有F227S渐变会引导SEC24B功效的实足流失。斑马鱼不妨动作接洽PCP旗号道路中中心基因渐变与NTD关系性接洽的平台。

来源：半壳优胜育转载请保留出处和链接！

本文链接：http://87cpy.com/219071.html