论文摘要：乌头内生细菌群落结构及其与宿主生物碱合成关系研究

摘 要
内生细菌广泛存在于陆地、水生健康植物体内，与宿主形成了相互依存、协同进化的关系。大量的研究表明，内生细菌具有促进宿主生长、提高宿主抵御生物胁迫与非生物胁迫的能力，进而提高宿主环境适应性。药用植物有效成分不仅广泛用于医药、食品、化妆品等领域，而且在宿主次生生长阶段与环境相适应的过程中起着关键作用。因此，阐明药用植物内生细菌与宿主有效成分的关系是揭示药用植物宿主与内生细菌互作机制的关键所在。
附子是毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaeli Debx.）子根的加工品，是我国传统名贵大宗药材，被历版《中国药典》收录。附子的有效成分主要为新乌头碱、次乌头碱和乌头碱等生物碱类，具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛等功效，用于亡阳虚脱，肢冷脉微等疾病的治疗。乌头是我国乌头属中分布最广泛的种，据《中国植物志》记载，在我国不同区域，出现了黄山乌头（A. carmichaeli var. hwangshanicum）、展毛乌头（A. carmichaeli var. truppelianum）、毛叶乌头（A.carmichaeli var. pubescens）等变种，这些乌头变种的根系都可加工成附子。另外，大量的研究表明，乌头中的各类生物碱对人体、动物和微生物均有很高的“毒性”，与此同时，乌头体内依然生活着大量的内生细菌。那么均能入药的乌头及其变种内生细菌群落结构之间的差异是什么？是否存在与生物碱合成密切相关的内生细菌？
本文以采自陕西汉中、陕西户县、安徽黄山、浙江临安、甘肃兰州的乌头（即草乌）、黄山乌头、展毛乌头和毛叶乌头为材料，在研究分析其内生细菌群落异同的基础上，进一步“寻找”与生物碱合成密切相关的内生细菌，试图为乌头生物碱的积累与其内生细菌之间关系的揭示提供一定依据。本文的主要研究内容和结果如下：
1. 高效液相色谱法测定乌头及其变种根、茎、叶总生物碱的含量，结果表明乌头及其变种全株总生物碱含量最高是黄山乌头，总生物碱含量最低的是毛叶乌头。乌头及其变种不同组织部位总生物碱含量差异较大，根中总生物碱含量较茎和叶最高。
2. 以表面消毒完善的乌头根、茎、叶为材料，提取各个样品的DNA，针对各个样品变异较大的V4区（515F-907R），设计引物，进行16S rDNA-PCR扩增，随后进行高通量测序。分析研究乌头及其变种内生细菌多样性：（1）乌头及其变种的内生细菌类群由4门，9纲，16目，22科，36属组成；优势菌门是变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)；最优势属为mitochondria_norank（变
形纲门）。（2）在整株水平上，黄山乌头内生细菌多样性最丰富，其次是展毛乌头，最低是汉中产草乌。菌种分布均匀度最高是汉中产乌头，其次是展毛乌头，最低是黄山乌头。（3）PCA结果显示乌头及其变种内生细菌属聚为一类，说明乌头及其变种内生细菌属种类相似度非常高。（4）乌头不同组织部位中根中内生细菌物种丰富度高于茎和叶，叶中菌种分布均匀度高于根和茎。
3.在整株水平上，乌头及其变种内生细菌共同属有17个，生丝薇属和Massilia，二者与乌头总生物碱含量呈显著正相关。不同组织部位水平，生丝微菌属与乌头根中总生物碱呈显著正相关；黄色单胞菌属与茎中总生物碱相关的内生细菌属呈显著正相关，mitochondria_norank与茎中总生物碱相关的内生细菌属呈极显著负相关，WCHB1-60_norank与茎中总生物碱相关的内生细菌属呈显著负相关；假单胞菌属与叶中总生物碱相关的内生细菌属呈显著正相关。
本文的创新之处在于：（1）全面准确描述乌头及其变种的内生细菌群落多样性及类群组成；（2）筛选出与乌头主要有效成分生物碱合成密切相关的内生细菌类群。

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