论文摘要：中介蝮蛇毒GI-PA1和Intobin2基因的毕赤酵母表达及生物活性研究

   动静脉血栓、心肌梗死和脑梗死等血栓性疾病严重威胁着人类的健康，溶栓疗法被认为是治疗血栓性疾病最有效的方法。现在应用于临床的蛇毒溶栓剂主要为类凝血酶和纤溶酶。蛇毒纤溶酶原激活剂由于其半衰期长、选择性高，可专一性的将人Glu-纤溶酶原变为纤溶酶，使血栓溶解，也成为开发新型溶栓剂的一个方向。中介蝮蛇毒富含丝氨酸蛋白酶（蛇毒纤溶酶原激活剂和具有激肽释放活性的类凝血酶属于丝氨酸蛋白酶），在基础研究领域和医药领域具有重要价值。然而由于蛇毒资源有限，通过分离纯化难以量产，因此本研究以来自中介蝮毒腺cDNA文库的两个新型丝氨酸蛋白酶基因SP20638和SP46086为材料，采用毕赤酵母表达系统（GS115和SMD1168菌株）进行基因工程表达，获得表达产物，为后续研究和工业化生产中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶奠定基础。

   主要的研究内容如下：

   1.对中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶基因SP20638和SP46086进行生物信息学分析，结果显示：SP20638基因包含一个777 bp的开放阅读框，编码258个氨基酸；该基因编码的氨基酸序列属于丝氨酸蛋白酶的PA亚型，是纤溶酶原激活剂；SP20638基因编码的蛋白1-18位氨基酸残基为信号肽，19-24位氨基酸残基为前肽（Propeptide），25-258位氨基酸残基为成熟肽；N-糖基化位点为Asn44；形成的二硫键为Cys31-Cys163，Cys55-Cys66，Cys98-Cys256，Cys142-Cys210，Cys174-Cys189和Cys200-Cys225；活性位点为His65，Asp110和Ser204；成熟肽的分子量为25.4 KDa，理论等电点为5.30。SP46086基因包含一个783 bp的开放阅读框，编码260个氨基酸；该基因编码的氨基酸序列属于丝氨酸蛋白酶的KN亚型，是具有激肽释放活性的类凝血酶；SP46086基因编码的蛋白1-18位氨基酸残基为信号肽，19-24位氨基酸残基为前肽（Propeptide），25-260位氨基酸残基为成熟肽；N-糖基化位点为Asn123，Asn124；形成的二硫键为Cys31-Cys165，Cys52-Cys68，Cys100-Cys258，Cys144-Cys212，Cys176-Cys191和Cys202-Cys227；活性位点为His67，Asp112和Ser206；成熟肽的分子量为25.9 KDa，理论等电点为8.44。

    2.对中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶基因SP20638和SP46086进行密码子优化，并将优化后的基因送上海生工生物工程有限公司合成。结果显示：密码子优化后的SP20638基因mRNA折叠最小自由能由ΔG=-237.20 kcal/mol提高到ΔG=-173.30 kcal/mol，共对15个氨基酸的密码子进行了替换，总计85个位点，G+C含量从52%降为39%，基因全长729 bp。密码子优化后的SP46086基因mRNA折叠最小自由能由ΔG=-224.20 kcal/mol提高到ΔG=-173.80 kcal/mol，有17个氨基酸的密码子进行了替换，共计99个位点，G+C含量从48%降为38%，基因全长735 bp。为了方便后续研究，将优化后的SP20638基因命名为GI-PA1，优化后的SP46086基因命名为Intobin2。

    3.用限制性内切酶SnaBⅠ和NotⅠ对优化后的基因和pPIC9K载体进行双酶切，连接，转入大肠杆菌Top10菌株，经PCR，双酶切和测序鉴定重组表达载体的构建情况。结果显示：重组表达载体pPIC9K/GI-PA1和pPIC9K/Intobin2构建成功。 

    4.用限制性内切酶SacⅠ将重组表达载体线性化，以电转化的方法（电转参数为1500 V，25 μF，200 Ω）转入毕赤酵母菌株（GI-PA1基因转入GS115菌株，Intobin2基因转入SMD1168菌株），对阳性克隆用浓度为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL和4 mg/mL的抗生素G418依次进行筛选，并对4 mg/mL的YPD平板上的克隆用MM和MD平板进行表型鉴定，最后用PCR鉴定阳性克隆。将鉴定正确的阳性克隆进行初步诱导表达和Western-blot鉴定，筛选出表达量最高的菌株作为诱导表达菌株。结果显示：线性化的pPIC9K/GI-PA1转入GS115菌株中，线性化的pPIC9K/Intobin2转入SMD1168菌株，在G418浓度为4 mg/mL的YPD平板上获得了GS115转化子的5个高抗性转化子和SMD1168转化子的5个高抗性转化子（分别编号为1、2、3、4、5），通过MM和MD平板以及PCR最终确定所获得的GS115和SMD1168高抗性转化子均为甲醇利用快速型表型。经过初步的发酵诱导和Western-blot鉴定，选择了表达量高的GS115转化子2号菌以及SMD1168转化子1号菌作为诱导表达菌株，并分别命名为GS115/GI-PA1和SMD1168/Intobin2。

    5.对诱导表达菌株进行发酵条件的单因素优化，所选择的参数为时间、pH、甲醇添加量、温度和抗氧化剂，所得数据用SPSS软件分析。结果显示：GS115/GI-PA1的最佳诱导条件为：时间96 h，pH 6，甲醇添加量为1.5%，温度为25 ℃，添加终浓度为10 mmol/L的抗坏血酸；SMD1168/Intobin2的最佳诱导条件为：时间96 h，pH 5，甲醇添加量为0.5%，温度为25 ℃，无需添加抗氧化剂。

    6.以最优的发酵条件进行大规模诱导表达，用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，并测定纯化蛋白的酰胺水解活性、纤溶活性、纤维蛋白原水解活性。结果显示：用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白，rGI-PA1蛋白在35 KDa之下有一粗条带，rIntobin2蛋白在35 KDa处有一条较浅的条带。生物活性测定表明rGI-PA1和rIntobin2不能水解合成底物BApNA，不具有纤溶活性；rGI-PA1蛋白在2-3 μg时就能降解牛纤维蛋白原的Aα链和Bβ链，在略小于Aα链的位置出现新的降解带，在略小于Bβ链的位置也出现了新的降解带，并且对Bβ链的降解能力大于Aα链，不降解牛纤维蛋白原的γ链；rIntobin2蛋白在1 μg时就开始降解牛纤维蛋白原的Aα链和Bβ链，在小于Bβ链的位置出现了新的降解带，并且对Bβ链的降解能力远远大于Aα链，不降解牛纤维蛋白原的γ链。

    结论：本研究成功在毕赤酵母菌株GS115和SMD1168中表达了中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶基因GI-PA1和Intobin2，获得了重组菌株GS115/GI-PA1和SMD1168/Intobin2，并证明rGI-PA1和rIntobin2重组蛋白具有纤维蛋白原水解活性。这些工作为中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶的工业化生产和应用鉴定了基础，同时也对重组表达其他蛇毒蛋白酶具有一定的参考价值。

 

 

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